Grupa Szlaków Sygnałowych Komórki Nowotworowejzespół prof. Wiesławy Widłak

Opis działalności zespołu:

 

Tematyka badawcza pracowni Szlaków Sygnałowych Komórki Nowotworowej koncentruje się wokół czynnika transkrypcyjnego HSF1 (Heat Shock Factor 1). Analizujemy szlaki sygnałowe, które uaktywniają się w wyniku działania HSF1, zwłaszcza w warunkach stresowych. Badamy interakcje ścieżek zależnych od HSF1 i estrogenu oraz od HSF1 i NF-κB.

 

Aktywacja HSF1 jest ważnym elementem odpowiedzi na stres, wspierającym również proces nowotworzenia. Obecnie nasze wiodące projekty badawcze mają na celu wyjaśnienie mechanizmów prowadzących do aktywacji HSF1 pod wpływem estrogenu (17-β-estradiolu, E2) w nienowotworowych oraz nowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Planujemy również określić znaczenie HSF1 w transformacji nowotworowej indukowanej przez estrogen oraz w podtrzymywaniu wzrostu komórek nowotworowych.

W wyniku stresu proteotoksycznego (np. szoku termicznego) prowadzącego do aktywacji HSF1 w komórce uruchamiane są mechanizmy cytoprotekcyjne bądź destrukcyjne (apoptoza). Komórkowe mechanizmy stanowiące molekularny przełącznik pomiędzy tymi przeciwstawnymi procesami nie są dobrze znane. Z naszych dotychczasowych badań wynika, że HSF1 może aktywować inne zestawy genów w komórkach  opornych i wrażliwych na stres termiczny. W komórkach opornych indukuje on przede wszystkim syntezę białek HSP (ang. Heat Shock Proteins) mających charakter cytoprotekcyjny. Natomiast w komórkach wrażliwych (takich jak spermatocyty) pod wpływem stresu dochodzi do globalnego zahamowania transkrypcji. SPEN (SPEN homolog, transcriptional regulator; msx2-interacting protein) jest jednym z niewielu genów, których ekspresja w komórkach plemnikotwórczych rośnie na skutek aktywacji HSF1. Dlatego badamy udział białka SPEN w regulacji transkrypcji w komórkach plemnikotwórczych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem warunków stresu termicznego. Celem naszych badań jest również charakterystyka odpowiedzi na stres w komórkach o zróżnicowanej wrażliwości na stres, a w szczególności regulacji/ekspresji/funkcji białek proapoptotycznych aktywowanych w czasie stresu wytypowanych w naszych dotychczasowych analizach.

We współpracy z Politechniką Śląską prowadzimy projekt, w którym badamy oddziaływania ścieżek sygnałowych zależnych od HSF1 i NF-κB. Komórki poddane działaniu szoku termicznego nie wykazują indukcji ścieżki zależnej od czynnika NF-κB po stymulacji np. cytokiną TNFα. Celem badań jest znalezienie „okna czasowego”, w którym ścieżka NF-κB jest efektywnie blokowana po zadziałaniu szoku termicznego oraz wyjaśnienie mechanizmu tej blokady. Szukamy również różnic w sygnalizacji HSF1/NF-κB pomiędzy komórkami prawidłowymi i nowotworowymi. Na potrzeby modelowania (za pomocą narzędzi bioinformatycznych) wzajemnych interakcji pomiędzy HSF1 i NF-κB stworzyliśmy linie komórkowe z ekspresją czynników transkrypcyjnych znakowanych białkami czerwonej bądź zielonej fluorescencji (do mikroskopowych badań przyżyciowych).

Słowa kluczowe: transformacja nowotworowa, stres komórkowy, apoptoza, cytoprotekcja, białka HSP, HSF1, estrogen, NFκB, ChIP-Seq, RNA-Seq

 

Metody badawcze i techniki:

·         KlonowanieDNA

·         Hodowla komórkowa i badania funkcjonalne in vitro

·         Wykorzystanie wektorów lentiwirusowych i retrowirusowych

·         CRISPR/Cas9

·         PCR, ilościowy RT-PCR, macierze PCR

·         Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP-on-chip, ChIP-seq)

·         Western Blotting, testy Elisa i macierze białkowe

·         Immunohistochemia i immunocytochemia

·         Proximity Ligation Assay (PLA)

·         Cytometria przepływowa

·         Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna

·         Doświadczenia in vivo prowadzone na myszach

·         Uzyskiwanie myszy transgenicznych z użyciem techniki mikroiniekcji

·         Techniki Głębokiego Sekwencjonowania (Chip-Seq i RNA-Seq)

 

 

Specjalna infrastruktura badawcza:

·         Mikroskop Axiovert 135 (Zeiss)

·         Wyciągarka do kapilar Flaming/Brown Micropipette Puller (Sutter Instrument CO)

·         Mikroinjector 5424 (Eppendorf)

·         Mikrokuźnia

·         Aparat do sedymentacji grawitacyjnej komórek STA-PUT (Pro Science Inc., Canada)